Ing. Petra Cupperová: Expresia molekuly CD9 v reprodukčnej sústave hovädzieho dobytka a jej účasť v interakcii spermia-oocyt Ústav biochémie a genetiky živočíchov, Slovenská akadémia vied, Oddelenie imunogenetiky, Dizertačná práca, Bratislava, 2015, 102 strán Oplodnenie je zložitý proces, v ktorom dochádza k interakcii gamét za účasti viacerých proteínov nachádzajúcich sa na povrchu vajíčka a spermie. Predošlé štúdie uskutočnené u myší a ďalších druhov ukázali, že molekula CD9 má významnú úlohu v procese oplodnenia, pravdepodobne pri fúzii spermie a vajíčka. Cieľom nášho výskumu bolo urobiť analogické štúdie u hovädzieho dobytka; analyzovať prítomnosť, distribúciu a funkčné aspekty molekuly CD9 v reprodukčných orgánoch hovädzieho dobytka. Na detekciu bovinnej molekuly CD9 sme použili monoklonovú protilátku IVA-50, ktorá je špecifická pre bunky hovädzieho dobytka. V pokusoch sme na analýzu distribúcie molekuly CD9 použili nepriamy imunofluorescenčný test a imunoperoxidázový test ako imunohistochemickú metódu. Pre biochemické štúdie sme využili metódu elektroforetickej separácie proteínov, metódu western blotu a frakcionáciu membrán spermií. Z funkčného pohľadu sme CD9 charakterizovali v priebehu kapacitácie spermií, testom väzobnosti a technikou in vitro oplodnenia. Výsledky všetkých našich experimentov jednoznačne poukazujú na prítomnosť molekuly CD9 v samčom a samičom rozmnožovacom systéme hovädzieho dobytka. V imunoperoxidázovom teste mAb IVA-50 intenzívne reaguje takmer so všetkými bunkami tkanív pošvy, maternice a vaječníka. Pozitívnu reakciu sme zaznamenali aj na rezoch vaječníka s folikulárnymi oocytmi. V býčích pohlavných orgánoch sme tiež detegovali prítomnosť molekuly CD9 v kolagénovom tkanive a na bunkách hladkých svalov. Molekula CD9 je vysoko exprimovaná aj v prídavných pohlavných žľazách (prostata, mechúrikovitá žľaza). Prítomnosť CD9 sme potvrdili aj v tekutine prísemenníka, s vysokou intenzitou hlavne v tele prísemenníka. Zároveň sme zistili silné farbenie tkaniva v oblasti stereocílií epitelu v tele a chvoste prísemenníka. Prítomnosť CD9 v tekutine a v oblasti stereocílií poukazuje na sekréciu tejto molekuly epitelom prísemenníka. Zistili sme prítomnosť CD9 na býčích spermiách, kde doposiaľ nebola detegovaná. Na rozdiel od myších spermií, kde bola lokalizácia CD9 popísaná na plazmatickej membráne v oblasti ekvatoriálneho segmentu po akrozómovej reakcii a na vnútornej akrozómovej membráne, sme molekulu CD9 detegovali na plazmatickej membráne býčích spermií. Na nematurovaných a maturovaných oocytoch sme zaznamenali pozitívnu reakciu na plazmatickej membráne a pravdepodobne na vezikulách zasahujúcich do zóny pellucidy. Vplyv molekuly CD9 na proces oplodnenia sme najprv analyzovali na intaktných oocytoch s využitím testu väzobnosti, v ktorom sme hodnotili množstvo spermií naviazaných na zónu pellucidu. Po ovplyvnení spermií, oocytov, alebo oboch gamét súčasne mAb IVA-50 sme zaznamenali štatisticky významné zníženie počtu spermií naviazaných na zónu pellucidu v porovnaní s kontrolnou skupinou. Následne sme analyzovali vplyv molekuly CD9 na reprodukciu s využitím in vitro oplodnenia, pričom sme gaméty samostatne alebo súčasne preinkubovali s monoklonovou protilátkou IVA-50, respektíve pridali IVA-50 priamo do oplodňovacej kvapky. Pri hodnotení oplodnenia sme vo všetkých prípadoch, okrem opracovaných oocytov, zaznamenali signifikantnú redukciu počtu oplodnených oocytov voči kontrole. Výsledky naznačujú možnú funkciu molekuly CD9 už vo väzbe spermie na oocyt, ale následne aj vo fúzii spermie s oocytom. Kľúčové slová: molekula CD9, monoklonová protilátka IVA-50, pohlavný trakt, gaméty, reprodukcia

Ing. Petra Cupperová: Expression of CD9 molecule in bovine reproductive system and its participation in sperm-oocyte interaction Institute of Animal Biochemistry and Genetics, Slovak Academy of Sciences, Department of Immunogenetics, PhD thesis, Bratislava, 2015, 102 pages Fertilization is a complex process, where the interaction of multiple proteins found on the surface of gametes occurs. The proteins involved in this process are also some CD molecules. Previous studies performed in mice and other species have shown that CD9 molecule plays an important role in the process of fertilization, probably in the fusion of sperm and oocyte. The aim of our research was to perform analogous studies in cattle; analyse the presence, distribution and functional aspects of CD9 molecules in the reproductive organs of cattle. In all experiments, we used monoclonal antibody IVA-50, specific for the cells of cattle for detection of CD9. We analysed the distribution of CD9 using indirect immunofluorescence and indirect immunoperoxidase test. For biochemical studies, we used the method of electrophoretic separation of proteins, western blot analysis and fractionation of sperm membranes. From a functional point of view, we characterized the CD9 molecule during the processes of sperm capacitation, binding to oocytes and in vitro fertilization. The results of all our experiments clearly indicate the presence of CD9 molecules in male and female reproductive system of cattle. In immunoperoxidase test monoclonal antibody IVA-50 reacted strongly with nearly all kinds of tissue cells of the vagina, uterus and ovary. Positive reaction was observed on the sections of ovarian follicular oocytes. In bull genitals, we also detected the presence of CD9 molecule in collagen tissue and smooth muscle cells. CD9 molecule is highly expressed also in accessory bull glands (prostate, seminal vesicles). We have confirmed the presence of CD9 in the epididymal fluid of high intensity especially in the body of epididymis. We also observed a strong staining in epithelium stereocilia in the body and tail of epididymis. The presence of CD9 in the fluid and in the stereocilia points to secretion of CD9 molecules by epididymal epithelium. We found out the presence of CD9 on bull spermatozoa, which has not yet been detected. In contrast to mouse sperm, where the location of CD9 was described on the surface of equatorial segment of plasma membrane and on the inner acrosomal membrane of acrosome-reacted sperm, we detected CD9 molecule on plasma membrane of intact sperm. On immature and mature oocytes we have observed a positive reaction on plasma membrane and vesicles possibly extending into zona pellucida. To inspect the effect of CD9 molecule on the fertilization process, we first analysed intact oocytes in a binding assay where number of sperm bound to the zona pellucida was evaluated. After treatment of sperm, oocytes, or both gametes simultaneously by monoclonal antibody IVA-50, we noticed a statistically significant reduction in the number of sperm bound to the zona pellucida in comparison with a control group. Subsequently, we analysed the impact of CD9 molecule on reproduction using in vitro fertilization assay, where the gametes were independently or simultaneously pre-incubated with monoclonal antibody IVA-50, or IVA-50 was added directly to the fertilization drops. In the evaluation of fertilization; except for treated oocytes; a significant reduction in number of fertilized oocytes was found, compared to control group. The results suggest possible function of CD9 molecule in binding of sperm to the oocyte, but also in the fusion of gametes. Keywords: CD9 molecule, monoclonal antibody IVA-50, genital tract, gametes, reproduction